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  • 140512 Gap-Repair Cloningについて、実験医学・クローズアップ実験法で紹介します。本ページの内容について、具体例を上げて紹介しています。
  • 101115 GRCがinvitrogenからkit化されて発売されています。GeneArt?® Seamless Cloning & Assemblyという名前です。酵母のコンピテントセルやトランスフォーメーション試薬、大腸菌のコンピテントセル等もすべて含まれたキットです。これで、GRCも一般に広まることになるでしょう。このメージの役割も終わりかもしれません。ただし、だいたい一反応5,000円。ぼったくりです。

Gap-Repair cloningを使おう!

このページでは、簡便・高効率・安価なDNAクローニング法、Gap-Repair Cloningについて解説します。この手法は従来の制限酵素を用いたクローニングのややこしさをすべて解消する画期的な実験手法です。もし従来の制限酵素を用いたクローニングを行っている方でクロー(苦労)されている方は、まずはぜひこちらをご覧ください。

はじめに

出芽酵母の細胞内では相同組み換えの活性が非常に高く、25bp程度の相同領域があれば相同組み換えがおきてDNA断片が連結されます(正確には「組み換え修復機構」によって連結されます)。この活性を利用して、酵母細胞内で様々なプラスミドのコンストラクトを構築することができます。これを「Gap-Repair Cloning」と呼びます。

酵母を使ったGap-Repair Cloningは低コスト・高効率で、自由度が高く複雑な構造のプラスミドの構築も可能な、非常に便利な手法です。ただ一般の研究者にはあまり知られておらず、また酵母を用いるということで多少敷居が高いと思います。そこで酵母研究者以外の方が酵母のGap-Repair Cloningを導入するかどうかを判断される材料になればと思い、ここに解説をのせることにしました。

#本ページでは、Gap-Repair CloningをGRCと略させていただきます。



GRCの特徴(メリット)

  • 高効率
    90%以上の確率で組み換えがおきたプラスミドが得られます。
  • 低コスト
    Gateway Cloningのように(市販の)特別な酵素溶液を準備する必要がありません。
  • デザインの自由度が高い。
    • クローニングに用いる制限酵素部位をあれこれ考える必要がない。
      制限酵素部位をクローニングに用いませんので、制限酵素部位の情報を細かく知る必要がありません。利用する制限酵素について頭を悩まさなくてもいいのです(これは実は非常に大きなメリットです)。
    • クローニングに用いる塩基配列は何でも良い。
      Gateway Cloningでは相同組み替えに特定の配列しか使えません。GRCはどんな配列を選んでもいいのです。
    • 部位特異的置換や欠失などが作成できる。
      上の特徴を利用すれば、特定の塩基を置換したり欠失させたりも出来ます。
    • 複数の断片を結合できる。
      とにかく特異的で相同な25bp程度の相同な配列さえあれば(つくれば)、複数のDNA断片が結合できます。4断片くらいならば平気でつながります。
  • 長い断片を利用できる
    酵母への形質転換では、大腸菌のように長い断片が入りにくいということがありません。15kbくらいのプラスミドは平気で扱うことが出来ます。