フレームシフト変異?(2005,03,02)

コピー数をあげると致死になる遺伝子群が、本当に蛋白質がたくさんでることでトキシックになっているのか、単にDNAの配列が増幅したことによるアーティファクトなのかを調べる必要がある。

今までやっているのは(1)スタートコドン(ATG)のあとにAを挿入してフレームシフトを起こさせて蛋白質を作らせなくする方法。これはDNAの塩基配列を1塩基しか変えないのでコントロールとしては非常に良いと思われる。ただし、一度ストップしてから後ろのATGからもう一度翻訳が再スタートしないとはいえない(それがうまい具合に起きる可能性はかなり低いだろうが・・・)。

問題点は、

  • 1-A:Aを挿入するためのプライマーを遺伝子セットすべてについて設計・合成しなければならないこと
  • 1-B:プラスミドコンストラクションの効率が悪いことが予想されること

があげられる。すでに非常にトキシックなもの(5個程度)についてはプライマーを作成し、プラスミドも完成、ある程度予想された良い結果が出ているが、これを全部の遺伝子でやるか?

もう一つの方法としては、

  • 2:ノックアウトコレクションを利用してORFの部分だけマーカー遺伝子(KanMX)と完全に置き換えてしまう方法。
    これの大きな問題点は、ORF内部とはいえ、DNAの塩基配列をすべて取り替えてしまうことになる。ORF内部に何らかのトキシックなDNA配列があった場合、これでは完全なコントロールとはなり得ない。ただ、これは今までのプライマーセットをそのまま使えるという大きなメリットがあり、(1)の方法であり得る「もれ」ということも想定しないですむ。

DNAの配列が悪影響を及ぼすとすれば、一般的にはORFの外側にある転写因子結合部位などであろうから、この方法でも問題点は少ないだろう。ただ、転写産物の3’UTRが何か悪さをする場合は・・・これはこの方法では確かめられない。まあこれはしょうがないし、もしこういう現象が実際にあるのであればそれはそれで発見ではある。

今のところの決着点は、(2)の方法ということにしよう。

 

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2008-04-19 (土) 00:00:00