酵母実験プロトコル

 

酵母からのプラスミドの回収(KOAc法)

KOAc法
細胞を1.5mLエッペンチューブに入るだけ移し、1mLのDWで洗浄
↓ 遠心 15000rpm 1min
上清を捨て、500µL の 溶液1 と 20µLの ザイモリエース溶液 を加える
↓ 37℃ 1hr
↓ 遠心 15000rpm 1min
上清を捨て、沈殿した菌体に 250µL の 溶液2 と 25µL の 10%SDS を加える
↓ 65℃ 30min (初めの15分後ボルテックス)
100µL の 5M 酢酸カリウム を加える
↓ 氷中 30min
↓ 遠心 15000rpm 3min
上清を別のチューブへ移し、1 vol.(約0.4mL)の イソプロパノール を加える
↓ RT 5min
↓ 遠心 15000rpm 3min
上清を捨て 70%エタノール でリンス
↓ 遠心 15000rpm 3min
50µL の RNAase含む水(10µg/mL)を加える
↓ 65℃ 10min
保存(2µLを大腸菌のエレクトロポ―レーションに用いる)
 

試薬

溶液1
終濃度
Na2EDTA7.44g0.1M Na2EDTA (pH7.5)
Sorbitol36.434g1M sorbitol
up to 200mL
pH7.5に合わせてオートクレーブ
(NaOH 7粒+10N NaOH 20滴くらい又は10N NaOH 2mLくらいでpH7.5になる)

注意:0.5M Na2EDTA(pH7.5)で作ろうとすると初めからpHが7.5を超えてしまう


溶液2
終濃度
0.5M Na2EDTA5mL20mM
1M Tris-Cl (pH7.4)6.25ml50mM
up to 250mL
オートクレーブ


ザイモリエース溶液
終濃度
Zymolyase 100T100mg2.5mg/mL
1M sodium phosphate (pH7.5)0.4ml10mM
1.2M sorbitolup to 40ml1.2M
 

1.2M sorbitol

MW=182.17
1.2M = 218.6g/L = 109.3g/500ml

 

1M Sodium Phosphate Buffer

 

使う試薬のメーカー、型番

  • Na2EDTA ナカライテスク code 15130-95
  • D(-)-Sorbitol 和光一級 198-03755
  • Tris-Cl ナカライテスク code 35434-05
  • Zymolyase 100T ナカライテスク code 07665-55
  • Na2HPO4 ナカライテスク code 31801-05
  • NaH2PO4·2H2O ナカライテスク code 31718-15
  • 酢酸カリウム ナカライテスク code 28405-05