酵母の遺伝子解析

  • プラスミドを用いてDNAを導入する。
    • インテグレーションベクター
    • ARS ベクター
    • CEN ベクター(S. pombeには存在しない)
  • 相補性による遺伝子クローニング
    • 変異の表現型が劣勢であれば、その選択に対立する方法で、
    • 変異の表現型が優性であれば、それを選択する方法で、
      • ARSプラスミド上の、ゲノムもしくはcDNAライブラリーを変異細胞(yfgに変異がある)に形質転換する。
      • 野生型の表現型で選択する。
      • 表現型を抑圧した遺伝子をもつプラスミドを酵母から大腸菌に回収する。
      • 挿入断片の塩基配列を決定する。
      • クローンした抑圧性遺伝子が変異yfg遺伝子座に位置しているか確認する。つまり、クローンされた遺伝子が目的の遺伝子か、2次サプレッサー遺伝子かを確認する。

        ・ゲノムデータベースでクローンした抑制性遺伝子の配列の存在場所を確認し、YFG遺伝子と同じ場所にその抑制性遺伝子があるかをチェックする、あるいはクローンした抑制遺伝子のゲノム上の部位に選択マーカーをインテグレートする。

        ・変異型yfgを持つ細胞と掛け合わせる。

        ・もしクローンした抑制性遺伝子がYFGそのものならば、四分子解析で選択マーカーとyfgが2:2の分離を示すはずである。

  • 遺伝子置換
    • 1ステップ
      • 遺伝子破壊に有効
      • もし選択マーカーと酵母ゲノムに相同な末端領域を持つならば、直鎖状のPCR産物を用いることが出来る
    • 2ステップ
      • 目的の場所に目的の変異を導入するのに便利
  • Two-hybrid
    • Stanley Fields, Roger Brent
    • GAL4 あるいは LexA-BD-bait
    • GAL4 あるいは synthetic-AD-prey
    • 指示蛋白質 (His3, Leu2, lacZ)
    • 利用法
      • ライブラリーから「獲物」を見つける。
      • 「餌」と「獲物」が相互作用するのに重要な部位を同定する。
  • DNAマイクロアレイ
    • ゲノム全てを代表するDNAの断片を作成する。
    • 顕微鏡用のスライドガラスにアレイを付着させる。
    • 蛍光標識された目的の(c)DNAと、違う色で標識された対象を同時にハイブリダイズする。
    • スキャンして解析する。
  • ゲノムワイドな変異株ライブラリ
    • バーコード化された遺伝子破壊株
    • 合成遺伝子アレイ解析(SGA)
      • ゲノムワイドな合成致死と合成異常相互作用の同定

酵母の情報

2008-09-20 (土) 00:00:00