Gap-Repair cloningを使おう!
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[[トップページ]]
-140512 Gap-Repair Cloningについて、実験医学・クローズア...
-101115 &color(red){GRCがinvitrogenからkit化されて発売さ...
*Gap-Repair cloningを使おう！ [#qc587cc6]
このページでは、簡便・高効率・安価なDNAクローニング法、Ga...
**はじめに [#ncda4d8c]
出芽酵母の細胞内では相同組み換えの活性が非常に高く、25bp...
酵母を使ったGap-Repair Cloningは低コスト・高効率で、自由...
＃本ページでは、Gap-Repair CloningをGRCと略させていただき...
** GRCの特徴（メリット） [#o8267f7d]
-高効率~
90％以上の確率で組み換えがおきたプラスミドが得られます。
-低コスト~
Gateway Cloningのように（市販の）特別な酵素溶液を準備する...
-デザインの自由度が高い。~
--クローニングに用いる制限酵素部位をあれこれ考える必要が...
制限酵素部位をクローニングに用いませんので、制限酵素部位...
--クローニングに用いる塩基配列は何でも良い。~
Gateway Cloningでは相同組み替えに特定の配列しか使えません...
--部位特異的置換や欠失などが作成できる。~
上の特徴を利用すれば、特定の塩基を置換したり欠失させたり...
--複数の断片を結合できる。~
とにかく特異的で相同な25bp程度の相同な配列さえあれば（つ...
-長い断片を利用できる~
酵母への形質転換では、大腸菌のように長い断片が入りにくい...
-クローニングに用いるDNAを精製する必要がない~
PCRや制限酵素で処理したDNAをそのまま酵母に形質転換しても...
-酵母の表現型で選択することができる~
これは酵母研究者だけのメリットかもしれませんが、変異株の...
**GRCの特徴（デメリット） [#kdc3b226]
もちろんGRCにもデメリットがあります。
-酵母を使えなければならない。~
これが一般の研究者にとってもっとも大きな敷居だと思います...
-時間・手間がかかる。~
酵母でクローニングするために、酵母が生えてくるまでの3日ほ...
-プライマーが長くなる（コスト?）。~
制限酵素でのクローニングよりは多少プライマーが長くなりま...
-PCRによるエラー~
これを嫌う研究者はいます。しかしGRCに限らず、現在PCRを使...
**GRCを行うには [#a0ff1607]
以下に、実際にGRCを行うために必要な道具立てを書きます。
-酵母を使った実験系~
酵母を研究対象としてない研究室で、GRCを行うことが出来るか...
-クローニングに用いる酵母用のプラスミド~
その上で''目的の断片を組み込むプラスミド''が必要になりま...
以上が整った上でのGRCの手順です。実際の実験の流れは図をご...
#br
#ref(http://tenure5.vbl.okayama-u.ac.jp/~hisaom/HMwiki/me...
#br
+組み込みたいDNA（インサート）を用意する。~
両端に、ベクターと相同な25bp以上の領域((もっと短くても良...
--3の形質転換で、それをそのまま（未精製で）用いる。
+組み込まれるベクターを用意する。~
ベクターを制限酵素で消化します。組み込みたい領域の内側で...
--ベクターは、2カ所以上で切断した方がバックグラウンド（セ...
--ベクターは、制限酵素で1日以上消化したものの方がバックグ...
--熱処理や、アルカリフォスファターゼ処理は不要。
+1と2を混ぜて酵母を形質転換し、プラスミド用の選択マーカー...
+生えてきたコロニーを培養し、プラスミドをリカバー、大腸菌...
**GRCの活用事例 [#w2b94e1f]
GRCは様々に応用できます。例えば以下のように用いれば、部位...
#ref(http://tenure5.vbl.okayama-u.ac.jp/~hisaom/HMwiki/me...
その他、以下のような用途があります。
-GFPなどとの融合遺伝子の作成
-ノックアウトやトランスジェニックのためのコンストラクトの...
-新しいベクターの構築
**GRCのその他の解説と関連情報[#tb3f5d1f]
-[[佐賀大学・永野幸生先生のページ:http://www.iac.saga-u.a...
「GRCをやりたいが、酵母用のベクターを持っていない」という...
-&ref_paper(2828185);~
酵母でのGap-Repair Cloningの（おそらく）始めての報告とな...
-&ref_paper(20488990);~
2014.5.13追記：合成DNAからマイコプラズマの全ゲノムDNAを再...
**最後に [#j3a54fad]
GRCは非常に自由度の高いDNA構築系です。従来の制限酵素ーラ...
**FAQ [#w91912e8]
「最後に」の後ですが、GRCについていくつか疑問にあがりそう...
-酵母を扱ったことがないのだが？~
「バイオ実験イラストレイテッド〈7〉使おう酵母できるTwo Hy...
-なぜGRCは一般に広まっていないのか？~
一つには、酵母を使わなければならない（手間がかかる、一部...
--101115 &color(red){GRCがinvitrogenからkit化されて発売さ...
-他の生物でGRCは出来ないのか？~
実は大腸菌で出来るという報告があります。((例えば、http://...
これでゲノムワイドコレクションを作っていると主張している...
分裂酵母でも出来るという報告があります((例えば、&ref_pape...
私たちは最近、分裂酵母でのGRCが高効率で成功するということ...
私たちと川向先生のグループではGRCの効率が違う（>70%と~20%...
-&color(red){Clontechのin-Fusionとの違いは？};~
最近、[[Clontech（TAKARA）からin-Fusionという試薬が売り出...
-GRCに不可能はないか？~
いろいろあると思います。%%最大の弱点は、リピートが作れな...
2012.12.19追記：最近リピートも作れる方法を考案しました。...
#br
最終更新~
&lastmod();
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*Gap-Repair cloningを使おう！ [#qc587cc6]
このページでは、簡便・高効率・安価なDNAクローニング法、Ga...
**はじめに [#ncda4d8c]
出芽酵母の細胞内では相同組み換えの活性が非常に高く、25bp...
酵母を使ったGap-Repair Cloningは低コスト・高効率で、自由...
＃本ページでは、Gap-Repair CloningをGRCと略させていただき...
** GRCの特徴（メリット） [#o8267f7d]
-高効率~
90％以上の確率で組み換えがおきたプラスミドが得られます。
-低コスト~
Gateway Cloningのように（市販の）特別な酵素溶液を準備する...
-デザインの自由度が高い。~
--クローニングに用いる制限酵素部位をあれこれ考える必要が...
制限酵素部位をクローニングに用いませんので、制限酵素部位...
--クローニングに用いる塩基配列は何でも良い。~
Gateway Cloningでは相同組み替えに特定の配列しか使えません...
--部位特異的置換や欠失などが作成できる。~
上の特徴を利用すれば、特定の塩基を置換したり欠失させたり...
--複数の断片を結合できる。~
とにかく特異的で相同な25bp程度の相同な配列さえあれば（つ...
-長い断片を利用できる~
酵母への形質転換では、大腸菌のように長い断片が入りにくい...
-クローニングに用いるDNAを精製する必要がない~
PCRや制限酵素で処理したDNAをそのまま酵母に形質転換しても...
-酵母の表現型で選択することができる~
これは酵母研究者だけのメリットかもしれませんが、変異株の...
**GRCの特徴（デメリット） [#kdc3b226]
もちろんGRCにもデメリットがあります。
-酵母を使えなければならない。~
これが一般の研究者にとってもっとも大きな敷居だと思います...
-時間・手間がかかる。~
酵母でクローニングするために、酵母が生えてくるまでの3日ほ...
-プライマーが長くなる（コスト?）。~
制限酵素でのクローニングよりは多少プライマーが長くなりま...
-PCRによるエラー~
これを嫌う研究者はいます。しかしGRCに限らず、現在PCRを使...
**GRCを行うには [#a0ff1607]
以下に、実際にGRCを行うために必要な道具立てを書きます。
-酵母を使った実験系~
酵母を研究対象としてない研究室で、GRCを行うことが出来るか...
-クローニングに用いる酵母用のプラスミド~
その上で''目的の断片を組み込むプラスミド''が必要になりま...
以上が整った上でのGRCの手順です。実際の実験の流れは図をご...
#br
#ref(http://tenure5.vbl.okayama-u.ac.jp/~hisaom/HMwiki/me...
#br
+組み込みたいDNA（インサート）を用意する。~
両端に、ベクターと相同な25bp以上の領域((もっと短くても良...
--3の形質転換で、それをそのまま（未精製で）用いる。
+組み込まれるベクターを用意する。~
ベクターを制限酵素で消化します。組み込みたい領域の内側で...
--ベクターは、2カ所以上で切断した方がバックグラウンド（セ...
--ベクターは、制限酵素で1日以上消化したものの方がバックグ...
--熱処理や、アルカリフォスファターゼ処理は不要。
+1と2を混ぜて酵母を形質転換し、プラスミド用の選択マーカー...
+生えてきたコロニーを培養し、プラスミドをリカバー、大腸菌...
**GRCの活用事例 [#w2b94e1f]
GRCは様々に応用できます。例えば以下のように用いれば、部位...
#ref(http://tenure5.vbl.okayama-u.ac.jp/~hisaom/HMwiki/me...
その他、以下のような用途があります。
-GFPなどとの融合遺伝子の作成
-ノックアウトやトランスジェニックのためのコンストラクトの...
-新しいベクターの構築
**GRCのその他の解説と関連情報[#tb3f5d1f]
-[[佐賀大学・永野幸生先生のページ:http://www.iac.saga-u.a...
「GRCをやりたいが、酵母用のベクターを持っていない」という...
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酵母でのGap-Repair Cloningの（おそらく）始めての報告とな...
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2014.5.13追記：合成DNAからマイコプラズマの全ゲノムDNAを再...
**最後に [#j3a54fad]
GRCは非常に自由度の高いDNA構築系です。従来の制限酵素ーラ...
**FAQ [#w91912e8]
「最後に」の後ですが、GRCについていくつか疑問にあがりそう...
-酵母を扱ったことがないのだが？~
「バイオ実験イラストレイテッド〈7〉使おう酵母できるTwo Hy...
-なぜGRCは一般に広まっていないのか？~
一つには、酵母を使わなければならない（手間がかかる、一部...
--101115 &color(red){GRCがinvitrogenからkit化されて発売さ...
-他の生物でGRCは出来ないのか？~
実は大腸菌で出来るという報告があります。((例えば、http://...
これでゲノムワイドコレクションを作っていると主張している...
分裂酵母でも出来るという報告があります((例えば、&ref_pape...
私たちは最近、分裂酵母でのGRCが高効率で成功するということ...
私たちと川向先生のグループではGRCの効率が違う（>70%と~20%...
-&color(red){Clontechのin-Fusionとの違いは？};~
最近、[[Clontech（TAKARA）からin-Fusionという試薬が売り出...
-GRCに不可能はないか？~
いろいろあると思います。%%最大の弱点は、リピートが作れな...
2012.12.19追記：最近リピートも作れる方法を考案しました。...
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最終更新~
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