死ぬほどGFPを発現している酵母はミドリゾウリムシに食われることで科学に貢献する

以前このブログで、「酵母で死ぬほどGFPを発現してみました。」という実験を紹介しました。

死ぬほどGFP(緑色蛍光タンパク質)を発現した酵母(GFP酵母と呼ぶことにします)のコロニーは肉眼でも蛍光緑に見えます。培養液も緑色に濁ります。蛍光顕微鏡で観察したら眩しくてしょうがないほどです。全タンパク質を泳動したらぶっといバンドで見えます

このブログのエントリーを見つけられて、GFP酵母を使ってみたいと連絡をくださる研究者の方々が時々いらっしゃいます。その中で弘前大学の岩井先生のご依頼は、私の想像していないものでした。

岩井先生は原生生物・繊毛虫のゾウリムシの仲間でクロレラが共生しているミドリゾウリムシ(Paramecium bursaria)を研究されていて、酵母をエサにして培養する方法を確立されたそうです。さらに、ミドリゾウリムシがどのようにエサを食べ消化していくのかという様子を観察したいと考えていらして、ビカビカに光っているGFP酵母が使えるのではないかと考えられたそうです。

そんなオモレエ実験に私たちが作った酵母が役に立つならと、早速GFP酵母をお送りしました。

・・・それから5年。遂にこの研究が論文となりました。

ミドリゾウリムシに共生しているクロレラはクロロフィルを持っていて赤色の自家蛍光があり、緑蛍光のGFP酵母と区別できます(下図)。

Paramecium bursaria eating yeast

GFP酵母を食べるミドリゾウリムシ。赤い点は共生しているクロレラ

この様子をずっと観察すれば、ミドリゾウリムシが時間あたりに何個の酵母を食べて、それらが細胞内でどれくらいの時間で消化されるかを調べることができます。

さらに、ミドリゾウリムシの増殖状態や、共生体のある/なしでのエサの取り込みと消化にどのような関係があるのかを調べることもできます。実験の結果、共生体のがない方が酵母をたくさん取り込めるが、消化速度は共生体のある/なしでほとんど変わらないということがわかりました。

共生体がいることで光合成によるエネルギーを得ることができる反面、外部からのエサの取り込みには不利に働くという「トレードオフ」があるということのようです。

 

なお、このGFP酵母、私たちは「光るから楽しい」という理由で作ったわけではなく、細胞内のリソース分配を真面目に研究するために作ったものです。これはこれで細胞について色々面白いことを教えてくれるのですが、それとはまったく別に、ミドリゾウリムシに喰われるという形でも科学に貢献してくれるとは。

「繊毛虫を含む原生生物には細菌を補食するものが多いですが、真核生物をもっぱら補食するものもいる(はずな)ので、私としては、そのようなケースで今後使われるとうれしいです。」(岩井先生談)とのことで、今後この方法が原生生物の摂食の研究に使われる一般的な方法になることを期待したいです。

 

細胞周期のダイナミクスは「鹿威し原理」で動いている、という話。

Research Gateという研究者のコミュニティーサイト・データベースがあり、私も登録しています。

Research Gateからは、論文の引用があったりするとメールで知らせてくれるのですが、先日、「Congratulations, you’ve been ackwouledegd for your contribution to an article」というメールがきました。「論文の謝辞に名前が載っているよ」、ということです。論文の著者が載せる時に知らせる義務がないこともあり、「知らない間に感謝されてた」ということもおきえます。

今回のケースはそれで、Research Gateに共同研究者がアップロードした以前の論文で私の名前が謝辞に載っているということを、Research Gateが見つけてくれて、知らせてくれたということのようです。謝辞に名前が載ること自体は、もちろん名誉なことではあるのですが、大したことではありません。ただ、今回はその謝辞の一文が少しかわってました。

We are grateful to Hisao Moriya (Okayama University, Okayama, Japan) for pointing out that the mechanical device in our publication [24] is called Shishi Odoshi in Japan.

この文章をみて、私は10年前のエピソードを思い出し、それに謝辞として(知らず知らずに)答えてくれていた共同研究者に関心し、嬉しくなりました。

10年前、当時共同研究していた Attila Csikasz-Nagy が私たちの前でセミナーをした時、以下の論文の話をしました。

1. Irreversible cell-cycle transitions are due to systems-level feedback.

Novak B, Tyson JJ, Gyorffy B, Csikasz-Nagy A. Nat Cell Biol. 2007 Jul;9(7):724-8. PMID:17603504

そこで彼は、真核細胞の細胞周期のダイナミクスー特に細胞周期のM期終了からG1-S期が再びスタートするまでの不可逆性を説明するために、以下の(奇妙な)装置を使って解説していました。

細胞周期のダイナミクスを説明する奇妙な装置

細胞周期のダイナミクスを説明する奇妙な装置(論文1 Figure 1)

で、私はこれを見て、「これ、日本の伝統的な庭にある鹿威し(Shishi-Odoshi)というものと同じだよ」と彼に指摘したのです。

私自身、その当時細胞周期のダイナミクスに興味を持っていて、Attilaやその師匠の Bela Novak の論文を何度も何度も呼んでいて、「このダイナミクスは鹿威しと同じだ」とずっと思っていました。それを、彼に会った時に直接言えて良かったとその当時思ったのを憶えています。

で、その指摘がどう発展してかはしらず、月日は流れ・・・。先日、Research Gateからのメールで、上記の装置がちゃんと「鹿威し化」された論文が発表されていたということを知ったというわけです(以下)。

2. Systems-level feedback in cell-cycle control.

Novák B, Vinod PK, Freire P, Kapuy O. Biochem Soc Trans. 2010 Oct;38(5):1242-6. doi: 10.1042/BST0381242. Review. Erratum in: Biochem Soc Trans. 2010 Dec;38(6):1723. PMID:20863292

鹿威し原理で動く酵母の細胞周期

鹿威し原理で動く酵母の細胞周期(論文2 Figure 3)

私の指摘にちゃんと答えてくれていたんだと言うのがわかり、とても嬉しくなったとともに、「Research Gate 侮れず」、と思ったエピソードでした。

 

“KOD”ポリメラーゼに対する認識の世代間格差?

TOYOBOが販売しているPCR用の耐熱性DNAポリメラーゼに「KOD DNAポリメラーゼ」というものがあります。正確性や伸長性が高いということで利用価値が高く、この改良版が次々と販売されてきました。

KOD -plus-、KOD -plus- Ver.2、KOD FX、KOD FX Neo、KOD -plus- Neoなど。私の研究室では、KOD -plus- Neoを主に使っています。正確性に関しては、私たちの使い方ではエラーにしばしば悩まされるのでパーフェクトとは言えないのですが、それでも増幅効率が大変よいので大変重宝しています。

今回のエントリーはこの酵素の良し悪しではなく、名前の由来についての話です。

この酵素、私の記憶が確かなら、20年くらい前に販売になったのですが、その当時この酵素の宣伝のチラシに、「KOD polymerase = King Of DNA polymerase」と書いてあったと記憶しています。私は研究室のメンバーとこのネーミングについて話をした記憶が確かにあるのです。

その後、留学などで幾つかラボを変わった後、自分たちのプロジェクトのために最も適したPCR用酵素を探していて、KOD -plus- にたどりつきました。そしてある時、このKODの発見者である今中忠行先生の公演を聴く機会があり、そこで驚くべき事実(?)を知りました。

KODって、その酵素を持っていた超高熱菌Thermococcus kodakaranesis KOD1株の名前に由来してたんだと。そしてこの菌の名前は、鹿児島県の小宝島の硫気孔から見つかった事に由来していたんだと。要するに、KODの意味するところは「KODakara」だったわけです。

その時に、記憶との齟齬があった私は、とりあえず「King Of DNA polymerase」というキーワードでネットを検索してみました。ですが当時は発見できず。KODの説明には、上記の由来しか見当たらないのでした。

私の記憶違いかしらと思っていた昨日、岡山に来ていただいた千葉大学のM先生とビールを飲んでいる時に何かのきっかけでその話になり、M先生も確かに「KODとは、King Of DNA polymeraseのことだ」と記憶されていたのでした。そして、今だにそう信じていて学生にはそう説明しているとのことでした。

うちの研究室の学生たちにその話をするとみんな逆に驚き、「King Of DNA polymerase なんて話聞いたことない」というのでした。

いずれにせよ私の記憶はやっぱり間違っていなかった。ということで、この「世代間格差」は、ここで紹介するに値する話じゃないか、ということになった次第です。

で、今ウェブを検索してみると、TOYOBOの情報誌UPLOADの100号(2013年1月号)に、まさに当時(1995年だったようです)「King Of DNA polymerase として宣伝していた」という記事が見つかりました。

使っている酵素の名前の由来なんて、どうでもいいと言えばどうでもいいことなのですが、もしかしたらまだ、King Of DNA polymeraseだと信じている人もいるかもしれませんので(信じていてもまったく実害はないのですが)。

 

ウエスタンブロッティング、自動化への道(その1)

ウエスタンブロッティングー標的のタンパク質がいろいろな条件でどれくらい作られているのかを示す事に使われたりします。

分子生物学者はこの技術が大好き(?)で、論文のリバイスなどでもレフェリーが、「ウエスタンブロッティングをやって確かめろ」ということは非常によくあります。で、やってみると、そのタンパク質の意外な修飾がわかったりして、「やっぱりやってみるべきだっわ」と思うこともしばしば。

しかし、この技術、面倒くさい。時間もかかる。

典型的には、タンパク質を泳動し、メンブレンに移し、ブロッキング(1hr) →一次抗体(1hr) →洗浄x3(5min) →二次抗体(1hr)→洗浄x3(5min) →発色/発光。

基本、サザンブロッティングやノーザンブロッティングなど、ブロッティング絡みの技術は面倒くさいのですが、これら2つはPCRその他の技術を使うことで、ほぼ代替が可能になりました。

だがウエスタンはそうはいかない。

ウエスタンブロッティングの画像を複製する捏造が一時期問題になりましたが、その大きな原因は「面倒くさい」事によるのは間違いないでしょう。

一方で、上記の作業、特にメンブレンに移してからの作業は自動化できそうな気がします。みんな面倒くさいと思っているのだから、そこにビジネスチャンスがあるはず。

企業は10年ほど前から自動ウエスタン装置を作りはじめました。

私は、「待ってました」とばかり発売された装置を購入し、トライし、あまりうまくいかないことを知り失望し、そして次に出た装置を購入し・・・ということを繰り返してきました。

結論から言うと、未だ、これだという自動装置にはたどり着かず、上記の「手動ウエスタン」を面倒クセェと思いながら日々行っているのです。

悔しいので、その失敗の歴史(?)をここに残しておきたいと思います。第一回目は、BenchPro 4100(Invitrogen)です。2009年に導入しました。

BenchPro4100

 

論文のリバイス、人手がなかったため導入。メンブレンを自動処理してくれます。使用説明の動画がこちらにあります。とりあえず導入当初は目的を果たしてくれ、論文用のデータを出してくれました。

ただ、2つ大きな問題が。

1つ目はウエスタンの結果があまり綺麗でないこと。抗体溶液が均等に行き渡らなかったり、洗浄が十分でないことが原因と思われます。

2つ目は消耗品。これをウエスタンブロッティング一回ごとに1つ使います。

BenchPro4100のでかい消耗品

 

使いまわしができないようになっていて(右の赤い印)、一枚あたり2000円程度。このコストをどうとらえるかということなのですが、大量のウエスタンをするとなると馬鹿になりません。

・・・ということで結果として「お蔵入りマシーン」になってしまいました。この本体は、あまり人気がなかったようで2014年に生産終了となったようです。

(多分)第2回に続く

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追記:先程このエントリーを書こうと思って蔵から取り出してみたら、消耗品があと20回分程度あることがわかりました。このまま捨てるのは勿体無いので消耗品分は使ってみようと思い直しました。

 

遺伝子重複は、頑健性ではなく脆弱性を酵母のタンパク質相互作用ネットワークに付与する。

Gene duplication can impart fragility, not robustness, in the yeast protein interaction network.

Diss G, Gagnon-Arsenault I, Dion-Coté AM, Vignaud H, Ascencio DI, Berger CM, Landry CR. Science. 2017 Feb 10;355(6325):630-634. doi:10.1126/science.aai7685. PMID:28183979

遺伝子が重複する(ゲノム上で同じ遺伝子のコピーが増える)ことが進化の原動力となるという「遺伝子重複説」は、大野乾博士によって提唱されました。この説は、ゲノム生物学やシステム生物学の発展に伴って、多様な側面から検証がなされ、たくさんの興味深い発見につながっています。

遺伝子が重複することによる想像しやすい最大のメリットは、「バックアップ」です。同じ機能を持つ遺伝子が2つあれば、1つが壊れたとしてもその生き物は行きていられる。ただ、この考え方はあまり支持されていません。(バックアップがあることによって)壊れても何もおきない遺伝子がそもそもゲノム上に保持されにくい、あるいはバックアップとしてまったく同じ機能の遺伝子を保持し続けることのコストのほうが大きい、というようなことが理由としてあげらます。

したがって、重複した遺伝子がゲノム上に保持され続けるためには、保持せざるをえない理由があるか、重複した遺伝子の機能が急速に変化する必要があると考えられています。量の効果や機能分化、新規の機能獲得などがそれに当たります。

さて、この論文では、重複遺伝子を複数もつ出芽酵母を材料として使い、重複遺伝子の片方が壊れた時に、それがタンパク質相互作用のネットワークにどのような影響を与えるかを調べました。

ほとんどの場合、あるタンパク質は別のタンパク質と結合(相互作用)しながら機能します。過去の重複の結果生じた遺伝子がコードするタンパク質の多くは、その機能分化の結果、それぞれ違うタンパク質どうしと相互作用していることが多く見られます(下図)。

重複した遺伝子(赤と黄色)がコードするタンパク質は別々のタンパク質と相互作用するようになる。元論文Fig.1を改変。

 

この研究では、重複遺伝子の片方を壊した時に、タンパク質相互作用の状態がどうなるかを調べました。黄色を壊した時に、赤が行っているタンパク質の相互作用にどういう影響があるかと言うことです。可能性としては3つあります(下図)。1)何も起きない、つまり赤とタンパク質の相互作用には影響がない。2)「補償:Compensation」、黄色が行っていたタンパク質相互作用を赤が肩代わりする。3)「依存:Dependency」、黄色を壊したのに赤の相互作用まで破綻する。

重複遺伝子の片方を破壊した時に何が起きるか? 元論文Fig.1を改変。

 

この論文では、出芽酵母の重複遺伝子56ペアについてこれを調べました。いうのは簡単ですが、タンパク質相互作用を遺伝子破壊株で組織的に調べるのは、けっこう大変な実験です。この論文の価値の1つは、「遺伝子破壊株中でのタンパク質相互作用を組織的に調べる」という大規模実験をやってのけたことにあると思います(ちなみに、タンパク質相互作用はDHFRの分子相補により検出しています)。

結果として、56ペアのうち22ペアが補償の関係を持っていて、それと同様な数が依存の関係を持っているということがわかりました。

このあと、この論文では補償や依存を生み出す分子メカニズムを色々と調べています。例えば、補償は重複ペアどうしの相手の取り合いの結果生じているらしいこと、依存は重複遺伝子がコードするタンパク質同士が相互作用してホモマーを作るものに見られ、片方が壊れることでもう一方が不安定化することによって生じているらしいこと(下図)、などです。

依存が起きるメカニズム。自己相互作用するホモマーの重複から生じたヘテロマーが依存をおこす。元論文Fig.4より改変。

 

タイトルにもなった本論文の「キモ」はここです。

これまでの通説では、遺伝子重複は細胞のシステムに冗長性を生むなどして「頑健性:Robustness)」を付与すると考えられてきました。本研究での「補償」はまさにそれにあたります。ところが、「依存」という現象により、重複した遺伝子のペアの破壊がもう一方の機能損失にまで及ぶ、つまり遺伝子重複によって「壊れやすさ(脆弱性:Fragility)」が増えてしまうことがある、というのです。

 

この論文をパッと見たとき、私が最初に思ったのは、「補償や依存が半々で起きるんだったら、遺伝子重複は、そもそも遺伝子破壊に対する細胞システムの頑健性に対して中立的と考えるべきではないのか?」ということでした。

遺伝子重複に関する著名な研究者であるJianzhiGeorge ZhangやKenneth Wolfeらも、この論文の結論に対しては懐疑的なようです。遺伝子重複によってできたタンパク質相互作用ネットワークが、遺伝子重複されていないネットワークに比べて脆弱であることが示されていないというのが1つの理由です。

この論文の最大の発見は、大規模なタンパク質相互作用の解析というこれまで行われていなかった解析の結果、1つの必須な遺伝子から2つの必須な遺伝子が生じる「依存」というメカニズムを見つけたことだと思います。ですが、それが生命システムの脆弱性の発生原理と言って良いのかどうか・・・もう少し議論が必要だと思います。

それから、この論文ではほとんど遺伝子名が出てこなくて、図の中で解析されている遺伝子が何なのかわかりません。「全体の傾向を見るのに個別の遺伝子の機能は関係ない」という姿勢なのかもしれませんが、どの遺伝子がそういう振る舞いをしているのか知りたいし、遺伝子名がわからなければ追試もできません。あまり良い姿勢ではないなと思いました。

また、この解析は実験系の性質上、非必須遺伝子しか取り扱えません。必須遺伝子の方が破壊のインパクトが大きいわけですし、合成致死ネットワークの解析でも必須と非必須遺伝子では見えてくるものが違っていたわけで、必須遺伝子で同じことをやると結果もまた違うのかなと思いました。

 

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なお、この論文は遺伝子重複の研究の専門家である東北大学の牧野能士さんに紹介していただきました。このエントリーの執筆にあたっても議論・助言をいただきました。この場を借りてお礼申し上げます。

暗闇で光る酵母(のモデル)は相当かわいい

また3Dプリンターのエントリーです。

最近起きた出来事。

1)同僚のS先生が3Dモデリングソフトを導入し、試験管立てを3Dプリンターで作成された。さらに夜光の3Dプリンター用のフィラメントを入手された。

2)私に、出芽酵母の立体構造モデルを作る依頼があった(依頼自体はその後キャンセルになった)。

ということで、年度末、酵母細胞のモデルをデザインして、夜光のフィラメントで打ち出してみました。デザインには、123D Designというフリーソフトを使いました。

yeast_model

3Dプリンターで打ち出した出芽酵母(守屋デザイン)

 

光る酵母のモデル

 

自分で言うのも何ですが、相当かわいいです。

これまで私が打ち出してきた数々のタンパク質模型に全く興味を示さなかった家族や学生へのウケも大変良い。大抵皆ほしがります。

私たち酵母研究者は、「酵母はカワイイ」といつも言っています。先日岡山に来られたCharlie Boone先生も、盛んに「このネック(細胞の間のクビレ)がいいんだよ〜!」と仰っていました。しかし、酵母研究者以外には、たいてい伝わりません。

それがこのモデルを見ると「たしかにカワイイ」と言ってくれるのです。私は酵母の可愛さが実証された(?)事に大変な喜びを憶えます。

ただ、この酵母のデザイン、球が2つつながっているだけに見えますが、そこは酵母を知っていなければできない相当なこだわりがあったりします。自画自賛ですが、生物学的に正しくて、かつ酵母が最も可愛く見える状態を目指してデザインしてあります。

上記のS先生(ウーパールーパー研究者)が、この酵母モデルのデータを使って別のオブジェクトを作ってくださったのですが、その際に酵母の形が歪んでしまっていていて、全く生物学的に正しくない、「可愛くない形」になってしまいました。

ですが、S先生にはその違いがわからんのです。

出芽酵母の形は単に球が2つくっついているだけじゃないんです。カワイイと思わせる「歪み具合のバランス」があるのでしょう。

ブラックライトで蛍光を発する蛍光タンパク質モデルを3Dプリンターで作ってみた

以前、3Dプリンターを使ってタンパク質の立体構造モデルをプリントするエントリーを書きました。

その後も着実に(?)色々なタンパク質を打ち出してきました。

酵母の解糖系酵素タンパク質

Yeast Glycolytic Proteins

 

GFPとGFP結合タンパク質

GFP & GFP Binding Protein

 

緑色蛍光タンパク質(EGFP)と乳清タンパク質(アルブミンとグロブリン)―バリ付き

GFP & Whey proteins

 

その他もろもろ。デスク横の棚の上はタンパク質のモデルがゴロゴロとあります。

今まで打ち出した中で一番かっこよかったのはグルタミン酸受容体です。

Glutamate Receptor

 

最近、以前のエントリーをご覧下さった業者に電話をいただき、「ブラックライト(紫外線)で発光するフィラメントがあるのだけれど使ってみませんか」と言われました。

色は、緑・青・赤・黄色があるとのこと。「これで蛍光タンパク質プリントしたらまさに蛍光タンパク質じゃん!」と思った私は早速サンプルを送っていただきました。

緑・青・黄色GFP・BFP・YFPに対応するだろうということでGFPの3D構造で作りました。赤はRFPの中でもよく使われるmCherryの3D構造で作りました。

打ち出したらこんな感じ。ブラックライトを当てていないときでもGFPは若干緑っぽいです。mCherryはGFPと少し形が違うんですね。

ブラックライトを当てていないBFP, GFP, YFP, mCherry

 

さて、ブラックライトをあててみます。電気泳動で分離したDNAを見るために使う装置で下から照らしてみます。

ブラックライト照射で光るBFP, GFP, YFP, mCherry

 

こりゃ綺麗やわ!

いつもは私が次々と打ち出すタンパク質のモデルに一切興味を示さない学生どもがわらわらと集まってきました。光るって大事。

 

使ったのはセントラルテクノ株式会社のルミシスフィラメントです。一般的なABS樹脂と同じ条件でプリントできました。

 

「酵母研究ルネッサンス2016」を行いました

2016年11月29日に東京大学先端科学技術研究センターで「酵母研究ルネッサンス2016」を行いました(世話人:吉田知史(群馬大)・守屋央朗(岡山大)・河野恵子(名市大)・谷内江望(東大))。

大隅先生のノーベル賞受賞を受けて、酵母を研究対象としている若手のPI、あるいはこれからPIとなる研究者による「酵母研究への夢」を語る研究会です。

午後一杯酵母づくしの発表会。とても濃厚で有意義なものでした。夕方からは屋外でのバーベキュー!寒かったけど楽しかった!次回は関西でやる・・・かもしれません。


始めに 吉田知史(群馬大)

セッション1 酵母細胞生物学の復権

  • 河野恵子(名市大)「酵母で明らかにする、新しい老化のメカニズム」
  • 齋藤成昭(久留米大) 「酵母はメタボを救うか?~低グルコースストレスに対する細胞応答メカニズム~」
  • 神唯(ミシガン大) 「細胞周期、次の主役はオルガネラ」
  • 畠山理広(フリブール大)「細胞のセンサーを見つけたい」
  • 佐藤健 (東大)「酵母をいったんバラして組み立て直します 〜再構成して理解する小胞輸送〜」
  • 阿部文快(青学大)「物理計測の窓からのぞく細胞内の様子 〜酵母生物学との融合を目指して」
  • 飯田哲史 (東大) 「酵母からはじめるゲノム修復研究」
  • 加納純子(阪大)   「分裂酵母のサブテロメア全破壊から見えてきた染色体維持システム」

セッション2 酵母を用いた新技術

  • 谷内江望(東大)「最強のプロトタイピングツールとしての酵母」
  • 川島茂裕(東大)「Developing fission yeast for chemical biology」
  • 増本博司(長崎大)「CRISPR/Transposon gene integration(CRITGI)による染色体へのプラスミド導入法の確立」
  • 紀藤圭治(明治大)「MSを使って様々な視点から酵母のプロテオームを観察する」
  • 守屋央朗(岡山大)「そのタンパク質、どれだけ過剰発現できますか? 〜酵母じゃなきゃ言えないこと〜」

セッション3 酵母研究 次の20年 (話題提起 守屋央朗)

「酵母研究ルネッサンス2016」参加者の皆さん

「酵母研究ルネッサンス2016」参加者の皆さん

生命システムの美

Budding yeast cell cycle model

Yeast genome and proteome

Yeast dosage sensitive genes

あなたがやっているのが分子生物学かシステム生物学かすぐに見分けられる質問

以前のエントリー、「「分子生物学」とはどんな学問分野なのか(システム生物学との対比として)?」に関連して。

ふと思いつきました。あなたがやっているのが分子生物学かシステム生物学かすぐに見分けられる質問です。

 

「あなたがある実験をしました。すると、まったく機能の分からない遺伝子/タンパク質がでてきました。あなたはこの時嬉しいですか、嬉しくないですか?」

 

前者ならあなたは分子生物学をやっています。後者ならあなたはシステム生物学をやっています。